蛋白分離技術問題
作者：網管
來源：本站原創
日期：2015/7/11 9:26:24
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屬于：公司新聞
. TCA/丙酮法：
（1）取4g果肉，用液氮在研缽中將其研磨成粉。
（2）加入12.5%冰冷的TCA/丙酮（含0.07%β-巰基乙醇），勻漿液在-20 oC下放置3h，紗布過濾。
（3）濾液在20000g離心30min，收集沉淀。 （4）用冷丙酮洗3次，沉淀在4oC下干燥，備用。 2. 勻漿法：
（1）稱取4g果肉，用液氮在研缽中研磨成粉。
（2）加入4ml的勻漿緩沖液(勻漿液中含有20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 250 mM sucrose, 10 mM EGTA, 1 mM PMSF, 1 mM DTT, 以及1% Triton X-100)，繼續研磨。
（3）勻漿液20000g離心30min。
（4）將上清轉移到新的離心管中，加入終濃度為10%TCA溶液，4oC下放置2 h。 （5）20000g離心40min，收集沉淀。 （6）用冷丙酮洗3次，沉淀在4oC下干燥，備用。
3. 酚提取法：
（1）稱取4g果肉，用液氮在研缽中研磨成粉。 （2）加入4ml的勻漿緩沖液(勻漿液中含有20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 250 mM sucrose, 10 mM EGTA, 1 mM PMSF, 1 mM
DTT, 以及1% Triton X-100)，繼續研磨。
（3）勻漿液20000g離心30min。
（4）在上清液中加入等體積的pH7.8 Tris-飽和酚，充分搖蕩，混勻，10000g，4oC下離心30min，上層為水相，中間白色物質為雜質，下層為酚相。（注：當提高勻漿緩沖液中sucrose的濃度到1M時，酚相會出現在上層。） （5）回收酚相，加入5倍體積含0.1M 乙酸銨的預冷甲醇，充分混勻，-20oC下過夜，沉淀蛋白。 （6）沉淀用含0.1M
乙酸銨的預冷甲醇洗2次。預冷丙酮洗2次。 （7）沉淀在4oC下干燥，備用。
雙向電泳實驗過程及相關溶液配置
A． 實驗過程
一、 實驗原理：2-DE的第一向電泳等電聚焦是基于等電點不同而將蛋白粗步分離，第二向SDS-PAGE是基于蛋白質分子量不同，而將一向分離后的蛋白進一步分離。這樣就可以得到蛋白質等電點和分子量的信息。 二、 實驗步驟：
1. 樣品的溶解
取純化后的晶體蛋白3.0mg，加入300ul裂解液(1mg蛋白:100ul裂解液)振蕩器上振蕩10min左右，共處理一個小時。其中每隔10～15分鐘振蕩一次，然后13200rpm離心15min除雜質，取上清分裝，每管70ul，—80oC保存。
2. Bradford法測蛋白含量
取0.001g BSA（牛血清白蛋白）用1ml超純水溶解,測定BSA標準曲線及樣品蛋白含量。 取7個10ml的離心管，首先在5個離心管中按次序加入0ul, 5ul, 10ul, 15ul, 20ul 的BSA
溶解液，另2管中分別加入2 ul的待測樣品溶液，再在每管中加入相應體積的雙蒸水（總體積為80ul），然后，各管中分別加入4ml的Bradford液（原來配好的Bradford液使用前需再取需要的劑量過濾一遍方能使用），搖勻，2min在595nm下，按由低到高的濃度順序測定各濃度BSA的OD值，再測樣品OD值。(測量過程要在一個小時內完成)。例如：
編號 蛋白量（ul） Buffer(ul) Bradford(ml) OD595值 1 0 80 4 0 2 5 75 4 0.024 3 10 70 4 0.061 4 15 65 4 0.091 5 20 60 4 0.116 Bt4 2 78 4 0.079 Bt4 4 76 4
轉Bt4 2 78 4 0.075 轉Bt4 4 76 4
標準曲線方程式：Y= aX+b.其中Y為 OD值，X為蛋白含量。 a、b通過作圖輸入數據可知
相關系數通過輸入數據，作圖，軟件分析可得
OD值測量過程：
比色皿用70%的乙醇保存，待用時用雙蒸水沖洗，再用無水乙醇沖洗，雙蒸水沖洗，再加入待測樣品溶液潤洗，然后，加入樣品，測定OD值。 3. 雙向電泳第一向---IEF（雙向電泳中一律使用超純水） 3.1 水化液的制備 稱取2.0mg 的DTT，用700ul水化液儲液溶解后,加入8ul 0.05% 的溴酚蘭，3.5ul（0.5%v/v）IPG buffer (pH 3-10)振蕩混勻，13200rpm離心15min 除雜質，取上清。
在含300ug 蛋白（經驗值）的樣品溶解液中加入水化液，至終體積為340ul， 振蕩器上振蕩混合,13200rpm離心15min除雜質，取上清。 3.2 點樣，上膠
分兩次吸取樣品，每次170ul, 按從正極到負極的順序加入點樣槽兩側，再用鑷子撥開Immobiline DryStrip gels (18cm，pH 3—10)膠條，從正極到負極將膠條壓入槽中,膠面接觸加入的樣品。注意：膠條使用前，要在室溫中平衡30分鐘；加樣時，正極要多加樣，以防氣泡的產生；壓膠時不能產生氣泡；酸性端對應正極，堿性端對應負極；樣品加好后，加同樣多的覆蓋油(Bio-Rad)，兩個上樣槽必須與底線齊平。 3.3 IPG聚焦系統跑膠程序的設定（跑膠溫度為20oC） S1 (30v, 12hr, 360vhs, step) S2 (500v, 1hr, 500vhs, step)
S3 (1000v, 1hr, 1000vhs, step) S4 (8000v, 0.5hr, 2250vhs, Grad)
S5 (8000v, 5hr, 40000vhs, step) 共計44110vhs, 19.5小時
其中S1用于泡脹水化膠條，S2和S3用于去小離子，S4和S5用于聚焦
3.4 平衡
用鑷子夾出膠條,超純水沖洗后，在濾紙上吸干（膠面，即接觸樣品那一面不能接觸濾紙，如果為18cm的膠條要將兩頭剪去），再以超純水沖洗，濾紙吸干（再次沖洗過程也可省略）
然后用鑷子夾住膠條以正極端（即酸性端）向下，負極端（即堿性端）向上，放入用來平衡的試管中（鑷子所夾的是堿性端，酸性端留有溴酚蘭作為標記），用平衡液A，平衡液B先后平衡15min。 注:平衡時要注意保持膠面始終向上,不能接觸平衡管壁。
平衡第二次時，在沸水中煮Marker 3min,剪兩個同樣大小的小紙片，長度與一向膠條的寬度等同，然后吸取煮好的Marker，轉入SDS—PAGE膠面上，保持緊密貼合；同樣在第二次平衡時，煮5%的瓊脂糖10ml。
4. 雙向電泳第二向---SDS-PAGE 4.1 配膠(兩根膠條所用劑量)
分離膠：（T=8% 80 ml）：溶液于真空機中抽氣后再加APS和TEMED 30 % 丙烯酰胺儲液 21.28ml
分離膠buffer 20ml 10%APS 220ul TEMED 44 ul 雙蒸水 38.72ml 濃縮膠：（T=4.8% 10ml）
30 % 丙烯酰胺儲液 1.6ml
濃縮膠buffer 2.5ml 10%APS 30ul TEMED 5ul
雙蒸水 5.9ml 4.2 灌膠
將玻璃板洗凈后,室溫晾干,然后,將電泳槽平衡好,玻璃板夾好,再在玻璃板底部涂上凡士林以防漏膠,倒入正丁醇壓膠,凝膠后(這時會出現三條線),用注射器吸去正丁醇,超純水洗兩次,再用濾紙除水后,倒入濃縮膠,正丁醇壓膠,凝膠后,用注射器吸去正丁醇,超純水洗兩次,再加入超純水,用保險膜封好。 4.3 轉移
剪兩個小的濾紙片，吸取Marker后，放入SDS—PAGE膠面的一端。然后，將平衡好的IPG膠條貼靠在玻璃板上,加少量的5%的瓊脂糖溶液在膠面上(瓊脂糖凝膠在轉移前十幾分鐘的時候配好,水浴加熱溶解,并保持燒杯中水處于沸騰狀態,至用之前再拿出來),再將IPG膠條緩緩加入SDS—PAGE膠面,其中不斷補加5%的瓊脂糖溶液,注意不能產生氣泡。 4.4 跑膠
濃縮膠 13mA 分離膠 20mA 共約5.5個小時 5. 銀染(兩根膠條所用劑量)（銀染特別注意用超純水）
5.1 固定 30min 無水乙醇 200ml+乙酸50ml，用超純水定容至500ml 5.2 敏化 30min 無水乙醇 150ml Na2S2O3?5H2O 1.5688g 無水乙酸鈉 34g
先用水溶解Na2S2O3?5H2O和乙酸鈉,再加乙醇,最后定容至500ml 5.3 洗滌 5min × 3次 5.4 銀染 20min AgNO3 1.25g 用超純水定容至500ml 5.5 洗滌 1min × 2次
5.6 顯影 無水Na2CO3 12.5g 用超純水定容至500ml 甲醛(37%)0.1ml, 臨時加
5.7 終止 10min EDTA—Na2?2H2O 7.3g 用超純水定容至500ml 5.8 洗滌 5min × 3次
注：整個雙向電泳實驗中全部使用超純水，盡量減少離子的影響。 B． 實驗相關試劑配制
1． Bradford 工作液
95%乙醇 25ml 先用乙醇溶解考馬斯亮蘭G250，溶解完后再加磷 85%磷酸 52ml 酸，最后超純水定容至500ml。過濾后置于棕色瓶 考馬斯亮蘭G250 0.035g 外加油皮紙保存（Bradford不穩定，一周內有效） 2． 裂解液 尿素 8M 硫脲 2M
CHAPS 4% DTT 60 mM
Tris—base 40 mM（如果有條件可以添加PMSF 0.5mM和5%的Pharmalate） 3. 水化液儲液 尿素 8M 硫脲 2M CHAPS 4%
Tris—base 40 mM
4. 分離膠buffer (pH8.8) 250ml SDS 0.4% 1g
Tris—HCl 1.5M 45.4275g
5. 濃縮膠buffer (pH6.8) 100ml SDS 0.4% 0.4g
Tris—HCl 0.5M 6.07g
6. 凝膠儲存液（30%的丙烯酰胺） 250ml Acr 29.2% 73g Bis 0.8% 2g
7. 電極緩沖液（跑一次要配制2500ml） 甘氨酸 43.2g 36g Tris 9g 或 7.5g
SDS 3g 2.5g
超純水定容至3000ml 超純水定容至2500ml 8． 0.5M Tris —HCl pH 6.8儲液
6.1g Tris先用30ml超純水溶解，再用46ml，3M HCl調pH6.8,再加水定容至100ml 9． 平衡液儲液
脲（即尿素） 36g
甘油 30% 30ml
SDS 1% 1g
0.5M Tris—HCl pH6.8 10ml 超純水定容至100ml 10. 平衡液A（一根膠條） DTT 20mg 平衡液儲液 10ml 11．平衡液B（一根膠條） 碘乙酰氨 300mg
平衡液儲液 10ml
0.05%溴酚蘭 15ul (平衡液A、B均需臨時配制) 12．0.5%瓊脂糖10ml
瓊脂糖 0.05g
電極緩沖液 10ml 溴酚蘭 25ul
補：4、5、6的溶液需過濾后儲存于4OC備用。 C． 藥品
CHAPS 兼性離子去垢劑 去垢劑可破壞蛋白質分子之間的疏水相互作用， SDS 離子型去垢劑 提高蛋白質的溶解性，防止在等電聚焦時析出
尿素 離液劑 可改變或破壞氫鍵等次級鍵的結構，使蛋白質 硫脲 離液劑 變性并使蛋白失活。尿素和硫脲聯合使用，可 以大大增加蛋白質的溶解性
DTT 還原劑 斷裂蛋白質分子中Cys殘基之間形成的二硫鍵，增加蛋白質的溶解性。但過分提高DTT的濃度，由于它pKa在8左右，因而會影響pH梯度。DTT在堿性pH下會去質子化，等電聚焦時會損耗，導致二硫鍵復原，蛋白質沉淀
BSA Bradford中制作標準曲線用
無水乙醇 和磷酸一起，提供Bradford中的環境 磷酸 提供Bradford中的酸性環境
Tris 構成緩沖液的成分，可用于抗衡pH的變化 IPG buffer
覆蓋液 即礦物油，防止水分蒸發，樣品干燥。
丙烯酰胺（Acr） 以丙烯酰胺為單體，甲叉二丙烯酰胺為交聯劑，
甲叉二丙烯酰胺 （Bis） 在催化劑（Aps）和引發劑（TEMED）作用下，聚合交聯成三維網狀結構
瓊脂糖
溴酚蘭 指示劑作用
碘乙酰氨（IAA） 平衡液B中使用，中和A液中的DTT 正丁醇 比聚丙烯酰胺密度小，用于凝膠制作過程中的壓膠 甘油 無機鹽的良好溶劑，熱穩定性好
Marker
考馬斯亮蘭G250（Bradford法用） 考馬斯亮蘭G250有紅、藍兩種不同顏色的形式在一定濃度的乙醇及酸性條件下，可配成淡紅色的溶液，當與蛋白結合后，產生藍色化合物，反應迅速而穩定，反應化合物在465~595nm處有最大的光吸收值，化合物顏色 深淺與蛋白濃度的高低成正比關系，因此可檢測595nm的光吸收值的大小計算蛋白的含量 甘氨酸 與Tris構成緩沖系統 AgNO3
EDTA 金屬螯合劑，可以結合銀離子，終止銀染過程